（一）什么是3d悬浮细胞培养系统，定义？

 

 

3D悬浮细胞培养系统是一种先进的体外细胞培养技术，其核心在于无需固体支架或基质附着，直接在动态悬浮的营养培养基中培养细胞。在该系统中，细胞通过自组装或特定培养条件（如微载体、低粘附表面、旋转生物反应器、悬滴法、磁悬浮，北京基尔比生物科技公司研制生产的3d悬浮细胞培养系统等）形成三维（3D）聚集体、球状体（Spheroids）或类器官（Organoids）。与传统单层（2D）贴壁培养相比，它还原了细胞在活体组织中的三维空间结构、细胞间相互作用以及微环境信号，是构建更接近生理状态的体外模型的革命性技术。

 

1.  模拟体内三维微环境与细胞间相互作用：

   细胞在三维空间中自由生长、迁移和相互作用，形成复杂的细胞-细胞连接和细胞外基质网络。这种结构直接影响细胞的基因表达、信号传导、分化和功能，使其行为（如增殖、代谢、药物反应）更接近体内真实情况。

 

2.  支持复杂组织结构形成与功能表达：

    系统能促进细胞自组织形成具有空间异质性的结构，如肿瘤球体（模拟实体瘤的缺氧核心和增殖外层）、肝细胞球体（形成类似胆管的结构）、神经球（形成神经网络）以及高度复杂的类器官（如迷你肠、肾、脑等）。这些结构能更好地展现源组织的特定功能（如药物代谢、屏障功能、电信号传导）。

 

3.  提供动态培养环境：

    通过搅拌、旋转或灌注等方式，例如北京基尔比生物科技公司研制生产的3d悬浮细胞培养系统系统可实现对培养基的持续混合，确保营养物质和氧气的均匀分布，并及时清除代谢废物。这种动态环境比静态培养更能模拟体内的流体剪切力和物质交换，尤其适用于模拟血管化组织或研究流体力学对细胞的影响（如内皮细胞）。

 

4.  实现高通量筛选与分析：

    形成的3D球状体或小聚集体大小相对均一，非常适合在微孔板中进行自动化操作和高通量应用，如药物筛选、毒性测试、基因功能研究。其生理相关性远高于2D模型，能提供更可靠的预测数据。

 

5.  适用于规模化培养与特定细胞类型：

    悬浮培养模式易于在Kirkstall Quasi Vivo 3D活细胞自动灌注动态构建培养系统中放大规模，用于生产细胞治疗产品（如干细胞、免疫细胞）或生物制品（如病毒、重组蛋白）。尤其适合本身在体内就是悬浮生长的细胞（如血液细胞、某些肿瘤细胞）或难以贴壁的细胞（如多能干细胞）。

 

北京基尔比生物科技公司研制生产的【3D悬浮细胞培养系统】通过提供无支架的三维动态环境，核心功能在于突破性地模拟体内组织的复杂结构与微环境，使体外培养的细胞展现出更真实的生理和病理行为。它在基础研究（发育、疾病机制）、药物研发（高通量筛选、毒性预测、个性化医疗）、再生医学（类器官、细胞治疗）等领域正迅速成为的强大工具，显著提升体外模型的预测价值和生理相关性。

 

（二）北京基尔比生物公司三维悬浮细胞培养案例

 

通过3D悬浮微培养技术，将成年患者的皮肤成纤维细胞直接重编程为功能性神经元，并展示了这些神经元在体外和体内实验中的稳定性和功能性。这项技术为神经退行性疾病的细胞替代疗法和疾病建模提供了新的可能性。

试验步骤

细胞准备

从皮肤活检中获取成年皮肤成纤维细胞（hDFs），并进行培养。

- hDFs培养于T175培养瓶中，使用未涂覆的培养瓶以避免细胞贴壁。

- 细胞在37°C、5% CO₂下培养。

细胞传代

当细胞达到90%汇合时，使用0.05%胰蛋白酶在D-PBS中传代。

- 传代比例根据实验需求调整。

- 传代后的细胞可用于后续的重编程实验或冷冻保存。

细胞重编程准备

将hDFs重悬于含有慢病毒的培养基中，准备进行3D培养。

- 使用超低吸附表面的锥形微孔板（如Elplasia板或Costar U型底微孔板）。

- 根据所需细胞球大小选择合适的微孔板。

3D细胞球形成

将细胞与慢病毒混合后，接种到微孔板中，通过离心使细胞均匀分布于微孔中。

- 离心条件：24小时，100g。

- 细胞在24小时内自组装成球形结构。

细胞球培养

在特定的培养基中培养细胞球，促进成纤维细胞向神经元的转化。

- 培养基：NDiff227，补充以下成分：早期神经诱导培养基（第0-16天） CHIR99021：2 μM SB431542：10 μM Noggin：0.5 μg/ml LDN1931189：0.5 μM VPA：1 mM LM22A4：2 μM GDNF：2 ng/ml NT3：10 ng/ml db-cAMP：0.5 mM 晚期神经诱导培养基（第16天后） LM22A4：2 μM GDNF：2 ng/ml NT3：10 ng/ml db-cAMP：0.5 mM

- 细胞球在培养期间保持空间分离，避免融合。

细胞球收获与移植

在培养一定时间后，轻轻收获细胞球，用于移植或其他实验。

- 使用玻璃毛细管进行移植，确保细胞球的完整性。

- 移植时避免对细胞球进行酶解或机械分离。

功能验证

对重编程后的神经元进行功能验证，包括电生理记录、钙成像和多巴胺释放检测。

- 电生理记录：使用全细胞膜片钳技术，记录细胞的动作电位和离子电流。

- 电生理记录和钙成像实验在培养60天后进行。

体内移植实验

将3D培养的神经元移植到成年大鼠的大脑中，评估其存活、成熟和功能整合。

- 移植部位：大鼠背外侧纹状体。

- 移植的细胞球大小为2000细胞/球，使用150 μm内径的玻璃毛细管进行移植。

关键结论

• 3D培养的优势：3D悬浮培养技术提供了一个有利于神经元转化和长期存活的环境，克服了2D培养中细胞附着和机械应激的问题。
   

• 功能性神经元的生成：通过3D培养技术，研究者能够生成具有功能性突触和神经递质释放能力的神经元。
   

• 体内移植的成功：3D培养的神经元在移植到成年大鼠大脑后能够存活、成熟并整合到宿主神经回路中，这为未来的细胞替代疗法提供了希望。
   

• 疾病建模和再生医学的应用潜力：这种3D培养技术为研究神经退行性疾病和开发新的治疗方法提供了新的工具。